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如何繪制和檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線
點(diǎn)擊: 次 時(shí)間:2017-02-18 10:37
概述
校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線,前者用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列直接測(cè)量,沒有經(jīng)過預(yù)處理過程,這對(duì)于樣品往往造成較大誤差;而后者所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過了與樣品相同的消解、凈化、測(cè)量等全過程。
凡應(yīng)用校準(zhǔn)曲線的分析方法,都是在樣品測(cè)得信號(hào)值后,從校準(zhǔn)曲線上查得其含量(或濃度)。因此,繪制準(zhǔn)確的校準(zhǔn)曲線,直接影響到樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確與否。此外,校準(zhǔn)曲線也確定了方法的測(cè)定范圍。
一、如何正確繪制校準(zhǔn)曲線
用一系列被測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的步驟,將被測(cè)物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩芤?,制備好的?biāo)準(zhǔn)系列和空白,在方法選定的波長(zhǎng)下,測(cè)定吸光度。已被測(cè)物濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線。
步驟:
1)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列,溶液以純?nèi)軇閰⒈冗M(jìn)行測(cè)量后,應(yīng)先作空白校正,然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;
2)標(biāo)準(zhǔn)溶液一般可直接測(cè)定,但如試樣的預(yù)處理較復(fù)雜致使污染或損失不可忽略時(shí),應(yīng)和試樣同樣處理后再測(cè)定;
3)校準(zhǔn)曲線的斜率常隨環(huán)境溫度、試劑批號(hào)和貯存時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件的改變而變動(dòng)。因此,在測(cè)定試樣的同時(shí),繪制校準(zhǔn)曲線最為理想。否則,應(yīng)在測(cè)定試樣的同時(shí),平行測(cè)定零濃度和中等濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份,取均值相減后與原校準(zhǔn)曲線上的相應(yīng)點(diǎn)核對(duì)。其相對(duì)差值根據(jù)方法精密度不得大于5%~10%,否則,應(yīng)重新繪制校準(zhǔn)曲線;
二、如何檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線
1)線性檢驗(yàn)
即檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線的精密度,對(duì)于以4~6個(gè)濃度單位所獲得的測(cè)量信號(hào)值繪制的校準(zhǔn)曲線,分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9990,否則應(yīng)找出原因并加以糾正,重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。
2)截距檢驗(yàn)
即檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度,在線性檢驗(yàn)合格的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行線性回歸,得出回歸方程y=a+bx,然后,將所得截距a與0作t檢驗(yàn),當(dāng)取95%置信水平,經(jīng)檢驗(yàn)無顯著性差異時(shí),a可做0處理,方程簡(jiǎn)化為y=bx,移項(xiàng)得x=y/b。在線性范圍內(nèi),可代替查閱校準(zhǔn)曲線,直接將樣品測(cè)量信號(hào)值經(jīng)空白校正后,計(jì)算出試樣濃度。
當(dāng)a與0有顯著性差異時(shí),表示校準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度不高,應(yīng)找出原因予以校正后,重新繪制校準(zhǔn)曲線并經(jīng)線性檢驗(yàn)合格。在計(jì)算回歸方程,經(jīng)截距檢驗(yàn)合格后投入使用?;貧w方程如不經(jīng)上述檢驗(yàn)和處理,就直接投入使用,必將給測(cè)定結(jié)果引入差值相當(dāng)于解決a的系統(tǒng)誤差。
3)斜率檢驗(yàn)
即檢驗(yàn)分析方法的靈敏度,方法靈敏度是隨實(shí)驗(yàn)條件的變化而改變的,在完全相同的分析條件下,僅由于操作中的隨機(jī)誤差導(dǎo)致的斜率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍,此范圍因分析方法的精度不同而異,例如,一般而言,分子吸收分光光度法要求其相對(duì)差值小于5%,而原子吸收分光光度法則要求其相對(duì)差值小于10%等。
三、如何正確的控制校準(zhǔn)曲線
被測(cè)物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩芤旱姆磻?yīng)稱為顯色反應(yīng)或發(fā)色反應(yīng),顯色反應(yīng)介質(zhì)的pH條件、顯色劑用量、顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度、為消除共存物干擾而加入的掩蔽劑、甚至加試劑的順序,都要按照方法步驟的要求執(zhí)行。有時(shí),標(biāo)準(zhǔn)系列雖然不像實(shí)際試樣那樣組成復(fù)雜,但仍要求與試樣進(jìn)行同樣的處理步驟,以便控制校準(zhǔn)曲線上的數(shù)據(jù)點(diǎn)的空白、回收率等因素。
建立校準(zhǔn)曲線時(shí),測(cè)量吸光度的參比有兩種選擇:
第一種方法用純?nèi)軇┳鲄⒈?,兩個(gè)比色皿都放溶劑時(shí),“樣品比色皿”的吸光度測(cè)定值為比色皿成對(duì)性校正值。此后,所有樣品吸光度測(cè)定值都須扣除此值,進(jìn)行校正,然后,以純?nèi)軇閰⒈?,測(cè)定空白及標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度,繪制校準(zhǔn)曲線。
第二種方法直接用空白為參比,當(dāng)兩個(gè)比色皿都放空白時(shí),測(cè)定比色皿成對(duì)性校正值,然后,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度,繪制校準(zhǔn)曲線。兩種方法得到的兩條校準(zhǔn)曲線互相平行,但第一種方法可測(cè)定空白的水平,后一種方法不能測(cè)定空白,理論上校準(zhǔn)曲線通過原點(diǎn)。若空白為零,兩條校準(zhǔn)曲線重合。無論用什么作參比,實(shí)樣測(cè)定時(shí)應(yīng)該使用與建立校準(zhǔn)曲線相同的比色皿和同樣的參比。比色皿的成對(duì)性校正對(duì)于使用已久的比色皿有必要,尤其是測(cè)量吸光度很小的樣品時(shí),校正可保證測(cè)量值的可靠性和重復(fù)性。
小結(jié)
使用校準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意:校準(zhǔn)曲線包括“標(biāo)準(zhǔn)曲線”和“工作曲線”。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溶液制作校準(zhǔn)曲線時(shí),如果分析步驟與樣品的分析步驟相比有某些省略時(shí),則制作的校準(zhǔn)曲線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果模擬被分析物質(zhì)的成分,并與樣品完全相同的分析處理,然后,繪制的校準(zhǔn)曲線稱為工作曲線。因此,如果基體效應(yīng)對(duì)分析方法至關(guān)重要時(shí),應(yīng)使用含有與實(shí)際樣品類似基體的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行校準(zhǔn)曲線繪制。
(內(nèi)容來源實(shí)驗(yàn)與分析)
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