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色譜峰值保留時間不穩(wěn)定怎么辦
點(diǎn)擊: 次 時間:2021-12-09 11:29
本文主要介紹在色譜實驗過程中經(jīng)常遇到的保留時間不穩(wěn)定問題,不同現(xiàn)象的解決方法如下。
一、用的同一臺儀器同一根色譜柱同一瓶流動相,保留時間在同一天變化大
1、首先檢查泵和混合器。使用秒表和量筒來檢測流速,具體方法是設(shè)置儀器流速1ml/min,用10ml量筒收集流出液10分鐘,應(yīng)該得到液體約10ml±0.5ml,量筒有誤差,使用的試劑與儀器廠家標(biāo)定泵流速時試劑不一樣,最終體積也有些差異,如果超過這個范圍,再分開通道檢測,以找到流速不正確的原因并排除。
2、檢查流動相組成是否變化,可以在流動相中加入跟蹤劑來觀察基線的變化,例如反相條件UV檢測器,在有機(jī)相中加入0.1%丙酮,監(jiān)測254nm下的基線變化。還有一種方法人工配制流動相,然后通過混合器,這時候保留時間穩(wěn)定了,不再波動,那就是混合器工作不正常,或者混合不均勻,進(jìn)行排除。
二、保留時間一天之內(nèi)正常,不同天數(shù)之間變化
1、可能是流動相的組成變化引起的。在反相色譜中,保留因子k和流動相中的有機(jī)溶劑的體積含量成指數(shù)關(guān)系,根據(jù)經(jīng)驗,如果有機(jī)溶劑含量誤差在1%,那保留時間的變化在5%-15%之間,大部分變化在10%左右,意味著用稱量有機(jī)溶劑的方式配置流動相能得到更穩(wěn)定的保留時間。
2、也可能是流動相的脫氣方式導(dǎo)致的。最好的脫氣方式是使用真空超聲脫氣大約1分鐘左右,非真空條件下超聲脫氣5分鐘,這樣會最大程度的減少溶劑的揮發(fā)。還有一種方法是流動相中通過氦氣,流動相被氦氣平衡后,氦氣流立刻關(guān)閉,避免氦氣帶走溶劑蒸汽,而導(dǎo)致溶劑組成改變。
3、流動相的抽濾方式。通常情況下如果我們使用有機(jī)溶劑和水相混合流動相時,會先將流動相配置混勻好后,再進(jìn)行抽濾,這樣的好處是流動相混合更均勻,但是對于流動相中沸點(diǎn)較低的部分,在抽濾過程中會損失更大,導(dǎo)致流動相溶劑組成改變,建議有機(jī)相和水相分開抽濾,再進(jìn)行混合,超聲脫氣。
4、流動相的PH值。檢測目標(biāo)物是離子狀態(tài)或者離子化的,那么控制流動相的pH就非常重要,就算是0.1單位pH的變化都有可能導(dǎo)致保留時間漂移10%左右,所以準(zhǔn)確稱量pH值并保證pH儀被很好的校正了,在反相色譜柱中,隨著pH值的升高,酸的保留會減少,堿的保留會增加。反相色譜中,分離離子或離子化的樣品,保留時間會受到正確緩沖溶液的離子強(qiáng)度的影響,但影響會很小,可以不計,典型狀況是緩沖鹽的摩爾數(shù)改變20%,保留時間的變化是1%,緩沖鹽的組成通常是稱量的,那么大的誤差是不會發(fā)生的。
三、保留時間漂移
1、如果使用的是未修飾硅膠柱做正相色譜,平衡是最有可能的原因,使用半飽和流動相改善。反相色譜中,平衡通常會很快,5-10個柱體積的流動相通常就足夠平衡了,但不全是如此,典型的就是離子對色譜中,使用離子對試劑平衡色譜柱,由于離子對試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度,它們要吸附在反相色譜柱填料表面,表面濃度在0.5-2μmol/m2,1根4.6*250mm的色譜柱大約有3g填料,需要2mmol的離子對試劑進(jìn)行完全的柱平衡,流動相濃度為2mmol時,那需要1L流動相進(jìn)行平衡,這個雖然是極端條件,但是用幾百毫升的流動相去平衡色譜柱也是正常的,因此離子對色譜中,使用了有機(jī)溶劑清除了離子對試劑,這樣第二天需要更長的時間平衡色譜柱。這兩個現(xiàn)象都是流動相中有低濃度的強(qiáng)吸附試劑導(dǎo)致的,這是保留時間漂移最常見的原因。
2、樣品中含有強(qiáng)吸附劑,在重復(fù)進(jìn)樣中會慢慢累積,從而改變色譜柱的化學(xué)性質(zhì),如藥品的賦形劑??梢酝ㄟ^觀察保留時間變化的速率來得知雜質(zhì)是從流動相中引入還是樣品中引入。
3、鍵合相水解。色譜柱制造商會制定一個pH范圍,超出范圍可能導(dǎo)致鍵合相不穩(wěn)定,但是很多情況下使用者不得不接近這個pH極限。水解還取決于其他因素,如溫度,有機(jī)溶劑,緩沖鹽的濃度和種類,樣品的化學(xué)性質(zhì)等,因此水解也可能發(fā)生在這個pH范圍內(nèi)。要保存固定相的水解穩(wěn)定性,最好是在中性pH值(3-5左右)和低溫下。等度條件穩(wěn)定性優(yōu)于梯度條件,在等度條件下發(fā)生水解的過程中,鍵合相通常會發(fā)生自我吸附,并達(dá)成一種區(qū)域平衡,在使用高濃度的有機(jī)溶劑時,在梯度時或者沖洗色譜柱時,這種平衡會被打破,鍵合相被沖出色譜柱。
4、溫度的變化。如果樣品是自動分析過夜或者過了周末,那保留時間的漂移可能和實驗室的溫度變化有關(guān),在很多地方室溫的設(shè)置在晚上或者周末是不一樣的,一般來講,1℃的變化導(dǎo)致保留時間的漂移大約在1%到2%。
5、反相色譜鍵合相發(fā)生了“相塌陷”。由于流動相中有機(jī)溶劑比例太少,高鍵合覆蓋率、“完全封端”的C18沒有很好的被流動相浸潤,這會使得流動相和固定相沒有很好的接觸,造成鍵合相卷曲,固定相之間相互吸附,從而導(dǎo)致固定相可以和樣品相互作用的表面積減少,使得保留時間逐漸變短。這時候立即用一定量的有機(jī)溶劑(建議40%乙腈水)沖洗色譜柱可以使鍵合相恢復(fù),這種現(xiàn)象在短鏈烷烴結(jié)合,未封尾的反相鍵合相上則很少發(fā)生或者是不發(fā)生。
(內(nèi)容來源儀器信息網(wǎng))
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