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磺胺類藥物是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，是一類用于預(yù)防和治療細菌感染性疾病的化學(xué)治療藥物，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常用的一類抗菌消炎藥。

一、原理

用乙酸乙酯提取，稀鹽酸反提取，正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相色譜柱分離，熒光檢測器檢測，磺胺5-甲氧嘧啶為內(nèi)標物，內(nèi)標法定量。

本方案是水產(chǎn)品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的液相色譜測定方法。

二、檢測儀器設(shè)備與試劑

液相色譜儀：配熒光檢測器。

電子天平：感量0.0001g，即萬分之一電子天平

電子天平：感量0.01g，即百分之一電子天平

高速組織搗碎機

均質(zhì)機

離心機

旋渦混勻器

氮吹儀

往復(fù)式振蕩器

聚丙烯離心管：15mL、50mL

容量瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL

玻璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL

巴斯德吸管

標準品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑，磺胺5-甲氧嘧啶，純度均大于98.0%。

丙酮：色譜純。

正己烷：色譜純。

乙酸乙酯：色譜純。

乙腈：色譜純。

甲醇：色譜純。

熒光胺：純度大于99.0%。

乙酸鈉：分析純。

冰乙酸：優(yōu)級純。

鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水并稀釋至1000mL。

乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取28.7g無水乙酸鈉溶于蒸餾水中，定容至100mL。

熒光胺溶液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加15mL丙酮，振搖至完全溶解，存放在暗處?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

標準儲備液：100mg/L，稱取標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

混合標準中間液：1mg/L，移取標準儲備液各1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。

內(nèi)標儲備液：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

內(nèi)標中間液：1mg/L，移取內(nèi)標儲備液1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。

混合標準使用液：取混合標準中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內(nèi)標中間液100μL，用2mol/L鹽酸(4.10)稀釋至2mL，配成濃度分別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標準使用液，其中內(nèi)標濃度為0.05mg/L。

注：本標準所用試劑在磺胺類藥物出峰處應(yīng)無干擾峰，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水標準。

三、色譜條件

色譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。

柱溫：45℃。

流動相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500mL水中加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0配制成乙酸溶液。

流速：1mL/min

進樣量：20μL。

激發(fā)波長：405nm。

發(fā)射波長：495nm。

四、檢測過程及結(jié)果

1、樣品制備

從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品，混勻，均分成兩份。裝入清潔容器，加封，標明標記。-18℃以下冷凍保存。

2、提取

將樣品解凍，稱取2.00g，置于50mL聚丙烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標準中間液(4.16)100μL，用玻璃棒攪勻，再加乙酸乙酯10mL，均質(zhì)機14000rpm均質(zhì)1min，往復(fù)式振蕩器振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至2mL。再向原離心管中加入乙酸乙酯10mL，旋渦混勻30s，振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到原15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至5mL。然后在試管中加入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液，旋渦混勻1min，加蓋后振動10min，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層，在余液中加入正己烷5mL，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

3、衍生

向樣品瓶中加入200μL混合標準使用液或樣品提取液、200μL乙酸鈉溶液和80μL熒光胺溶液，旋渦混勻30s，20min后供液相色譜分析。

4、色譜分析

取衍生后的樣品提取液20μL進樣，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標準樣品的保留時間定性，內(nèi)標法定量。

5、工作曲線

稱取空白樣品2.00g，分別添加混合標準中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺胺殘留量分別為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標，磺胺含量為橫坐標，繪制工作曲線。

6、方法回收率

濃度范圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時，回收率見下表：

7、方法檢出限

本方法檢出限為0.010mg/kg。

8、精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的15%。