概述

    在液相色譜分析過程中，我們經(jīng)常遇到的問題主要有二種，一種與液相色譜儀本身因素有關(guān)，如液相色譜的閥門、混合器、檢測器的光源以及其它的一些硬件設(shè)備。出現(xiàn)這類問題后，如果能找出問題根源，解決起來一般很簡單，而且這類問題可以通過對儀器的精心維護來避免；而另一類問題則是分析方法本身造成的問題，如出現(xiàn)色譜峰形狀不好、峰與峰之間不能分開、基線飄移等等。不幸的是，如果出現(xiàn)這類問題，看起來似乎很明顯，但是要找出原因并解決這類問題卻非常困難。為了減少出現(xiàn)這一類型的問題，就必須在分析之前，仔細(xì)研究并選擇一個好的分析方法，有了一個好的分析方法，就很容易獲得理想的分離效果，而且在出現(xiàn)問題是也很便于找出原因。要選擇一個好的分析方法，就必須對液相色譜分析的一些基本原則要有一個很深的了解。

一、分析方法選擇的基本原則

    假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是否齊全，如果少了配料還必須去商店購買，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進行液相色譜分析時，也必須按照一定的程序進行，首先你必須要有專門的儀器和試劑，然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結(jié)果，避免走一些彎路。

二、柱子的選擇

    現(xiàn)在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18和C8柱最為流行，然而，色譜分析并不是流行歌曲，這兩種色譜柱之所以運用廣泛是因為在大多數(shù)情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子(如表一所示)，但C18和C8經(jīng)常是最好的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，但在我們實驗室中以常使用的是C8柱。色譜分析人員遇到的多數(shù)樣品需要利用反相色譜柱進行分析，但一些樣品可能需要其它的分析技術(shù)才能成功地分離，這些樣品及分離方法在表一中作了簡要的敘述。

表一：樣品及分析方法


樣品及分析方法

    在過去的15年中，高純度、低金屬雜質(zhì)含量的硅膠基質(zhì)色譜柱是最為實用的色譜柱之一。但傳統(tǒng)色譜分析用的硅膠顆粒具有差異性及酸性表面，固定在柱子表面后，導(dǎo)致出現(xiàn)拖尾峰，而且柱與柱之間的重現(xiàn)性較差。最近硅膠基質(zhì)中出現(xiàn)一種新的產(chǎn)品，這種硅膠具有Metal-free特性，因此，柱子性能更穩(wěn)定，重現(xiàn)性也更好，分離后峰的形狀也很不錯。這種改性后的硅膠稱為B型硅膠。由于具有上述優(yōu)點，大多數(shù)色譜制造商都用不同的名稱來表明它們與傳統(tǒng)的產(chǎn)品之間的不同。大多數(shù)色譜柱制造商都生產(chǎn)以B型硅膠為基質(zhì)的色譜柱，因此你可以選擇你所喜歡的供應(yīng)商提供的產(chǎn)品。由于這種產(chǎn)品具有上述特性，建議使用A型硅膠柱的改為使用B硅膠柱。

三、柱子尺寸規(guī)格的選擇

    液相色譜分析時柱子選擇的另一個因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑(dp)的選擇。最常用顆粒直徑為5μm，但顆粒的直徑(dp)為3.0及3.5μm的也適合分析使用，但大多數(shù)色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5μm的色譜柱，因為這種色譜柱具有很長的使用歷吏。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數(shù)，但所需的柱壓增大，而且dp為3.0μm的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產(chǎn)出dp為3.5μm的色譜柱。

    在我們實驗室中經(jīng)常使用的是150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱。另一種可以選擇 的色譜柱為75mm×4.6mm，dp為3.5μm的柱子，這種柱子的分離效果與前一種色譜柱分離效果相似，但使用時間減小一半。這兩種柱子還有一個優(yōu)點就是在合理的壓力下(<2000psi )，流速可以設(shè)定在1.5-2.0mL/min之間，而流速高意味著可以縮短分析時間。

    有些分析者建議使用30 or 50mm長的柱子作為前處理柱，但這種柱子不能提供足夠的塔板數(shù)。另一種意見是使用窄孔柱(2mmid)或微孔柱(≤1mmid)，這兩種柱子所需的溶劑少，但是這兩種柱子所需的某些儀器與正常使用的色譜儀有些不同，而且正處在一個研究階段，建議等這兩種色譜柱研究成熟之后再使用。

    150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱最為常用，75mm×4.6mm，dp為3.5μm的色譜柱也中較常見，在一般情況下流速可設(shè)定為1.5mL/min。

四、有機相的選擇

    獲得成功分離的另一個重要因素就是流動相有機溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱可以有三種有機溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其獨特的優(yōu)點，但色譜分析人員很少能預(yù)見哪一種溶劑更合適，所以具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見。

    在我的實驗室中多數(shù)工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以，分析時紫外檢測器的波長為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強，所以在波長低于240nm時，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使用，但是在低于220nm時，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發(fā)生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時須格外小心。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，在四氫呋喃中加入水可以解決這個問題，但它與色譜柱平衡所需的時間比甲醇、乙腈長，而且其不愉快的氣味也是一個不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的最大優(yōu)點是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2mL/min之間。

    考慮到理想溶劑的特點，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以首選的有機溶劑應(yīng)是乙腈，當(dāng)然利用甲醇作為有機溶劑的也較為常見。

五、水相的選擇

     假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時普遍存在，而這類化合物需要控制pH值才能得到很好的分離。如流動相的pH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個單位。在分析有機酸時，當(dāng)pH值低于3時，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而當(dāng)PH值高于8時，就需要緩沖液，因為此pH值已經(jīng)超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對高pH值物質(zhì)的分離，很少有這方面的報道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。

    考慮到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析PH值較高的物質(zhì)時應(yīng)使用緩沖液，2.5mm的磷酸鹽緩沖液 (pH=2.5)是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選擇易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1%Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足pH值的控制要求。

六、其它因素

     在你選擇液相色譜的分析方法時，必須考慮到其它的一些因素，比如，溫度。因為溫度變化1度，保留時間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性，這會使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時柱溫一般比室溫高一點(如，35℃)，因為此溫易控制，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從而降低柱壓。有時你需要利用其它的一些方法，如在流動相中加入部分特殊的物質(zhì)，不過建議最好在你實在必須時才用這種方法，記住KISS原則(Keep it simple ，stupid)，不要使你的流動相過分復(fù)雜。

總結(jié)

    在液相色譜分析時條件的選擇非常重要，而且流動相是你常年與之打交道的，所以你必須慎重選擇。一些較為常見的分析條件如表二所示：

表二：分析條件內(nèi)容


分析條件內(nèi)容


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