水產(chǎn)品獸藥殘留檢測方法及能力驗證詳細說明
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一、水產(chǎn)品獸藥殘留檢測方法
獸藥殘留(animal drug residues)是指給動物使用藥物后蓄積或貯存在細胞、組織或器官內的藥物原形、代謝產(chǎn)物和藥物雜質。近10年來,水產(chǎn)品中獸藥殘留問題引起了社會的廣泛關注,也經(jīng)歷了貿易壁壘的多發(fā)期,直接影響著中國水產(chǎn)行業(yè)的轉型和升級。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中,非法使用違禁藥物、不遵守休藥期、生物體代謝差異和不合理用藥等都有可能導致獸藥殘留超標。
獸藥殘留分析的檢測手段多樣,酶聯(lián)免疫試劑盒、膠體金免疫試紙條和熒光試紙條等快速檢測產(chǎn)品能夠實現(xiàn)高通量、快速篩選,其靈敏度、準確性和時效性正在不斷優(yōu)化和革新;氣相色譜儀、液相色譜儀、氣相色譜-質譜儀、液相色譜-串聯(lián)質譜儀和高分辨質譜等儀器是實驗室常用的分析設備,具有定量準確、準確度更高等優(yōu)點,特別是具有高靈敏度、高分辨率的質譜儀,是進行陽性樣品確證分析的首選。
1、硝基呋喃類代謝物檢測方法
硝基呋喃類藥物是一類化學合成的廣譜抗菌藥物,常見的有呋喃唑酮(furazolidone,F(xiàn)ZD)、呋喃西林(nitrofurazone,NFZ)、呋喃妥因(nitrofurantion,NFT)和呋喃它酮(furaltadone,F(xiàn)TD),曾廣泛用于畜禽、水產(chǎn)等動物傳染病的預防與治療。硝基呋喃類藥物原藥及其代謝產(chǎn)物具有一定的毒性,有致畸、致突變和致癌的危險。出于安全性考慮,自1993年開始,歐盟、美國等發(fā)達國家和地區(qū)先后頒布了禁止使用該類獸藥的禁令。中國于2002年頒布的農(nóng)業(yè)部第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》,明確禁止使用硝基呋喃類廣譜抗菌藥物。但是由于硝基呋喃類藥物價格低廉、療效好,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍存在違禁使用的現(xiàn)象,在近幾年開展的水產(chǎn)品風險隱患排查工作中屢有檢出。
硝基呋喃類藥物在生物體內代謝迅速,很難檢測到原藥,因此標準方法都是對其代謝產(chǎn)物進行測定,表1中列出了當前適用于水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留測定的方法標準,均采用液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)進行測定,其中農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006是中國水產(chǎn)品質量安全監(jiān)控的推薦方法,該方法的適用范圍廣、定量準確、靈敏度高,是常用的檢測方法。
表1 水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留測定方法標準
2、孔雀石綠檢測方法
孔雀石綠(malachite green, MG)作為一種三苯甲烷類染料,曾廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的驅蟲劑和殺菌劑,以防治魚類水霉病、鰓霉病、及小瓜蟲病等,是一類抗菌效力較強的藥用染料。然而,MG不僅在生物體內有明顯蓄積現(xiàn)象,且迅速被代謝成隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)。在魚體內和環(huán)境中殘留時間長,具有潛在的“三致”作用,因此包括中國在內的許多國家都禁止其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。但是由于MG抗菌效果較好,價格低廉且無有效替代藥物等原因,在近幾年的監(jiān)控工作中發(fā)現(xiàn)MG仍在個別水產(chǎn)品種的養(yǎng)殖中違規(guī)使用。
表2是水產(chǎn)品中MG殘留測定常用的方法標準,GB/T 19857—2005 (第一法)和GB/T 20361—2006的檢測結果相近,差異不顯著,可根據(jù)實驗室情況自行選擇。但是與液相色譜法(LC)相比,LC-MS/MS前處理操作相對簡單,定性方式更準確,是進行陽性樣品確證的必要方法,也是農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質量安全監(jiān)控的首選方法。
表2 水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留標準測定方法
3、 氯霉素檢測方法
氯霉素(chloramphenicol,CAP)是1947年首次從委內瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取而得到的抗生素,具有廣譜抗菌作用,對多數(shù)G+、G-菌均有效,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能有效防治爛鰓、赤皮病。CAP對人類的毒性較大,可抑制骨髓造血機能、造成過敏反應,引起不可逆的再生性障礙貧血等。
美國、日本、韓國和歐盟等國家和地區(qū)均已禁止在食用性動物中使用氯霉素,并規(guī)定在動物源性食品中不得檢出。中國農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定CAP為禁用藥物,在動物性食品中不得檢出[6]。目前,CAP是中國水產(chǎn)品質量安全監(jiān)管的對象之一,其抑菌效果優(yōu)于其替代藥物,近年來在大宗水產(chǎn)品中的檢出率不高,但是帶入途徑復雜,仍是目前監(jiān)控的重點。
水產(chǎn)品中CAP殘留量的測定方法很多,包括酶標法、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)和LC-MS/MS等(表3)。其中酶標法用于CAP的快速篩查測定,氣相色譜法可以用于CAP的準確定量測定, LC-MS/MS和GC-MS法均可以作為CAP殘留的確證方法,在對陽性樣品的測定中,可以互為補充。
表3 水產(chǎn)品中氯霉素殘留標準測定方法
4、磺胺類
磺胺類藥物(sulfonamides, SAs)是對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱,主要用于預防和治療細菌感染性疾病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于治療魚、蝦、蟹、鱉等動物的細菌性疾病,防治鯉的赤鰭病,香魚、虹鱒等的弧菌病等。由于SAs在生物體內的作用時間和代謝時間較長,蓄積濃度超過一定值會對人體健康造成危害,導致很多細菌對SAs產(chǎn)生抗藥性[1]。
因此,許多國家都對SAs的使用限量進行了規(guī)定,歐盟規(guī)定肉類食品中磺胺類藥物的最高殘留限量(MRL)為:單一SAs藥物≤25 μg/kg,SAs總量≤100 μg/kg;日本肯定列表規(guī)定動物源性食品中單一SAs0.01~0.1 mg/kg,其中水產(chǎn)品為0.1 mg/kg;國際食品法典委員會與中國農(nóng)業(yè)部235號公告中均規(guī)定動物組織中SAs藥物的MRL為100 μg/kg。
表4是水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留測定的方法標準,其中農(nóng)業(yè)部958號公告-12-2007和農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008是常用的檢測方法,農(nóng)業(yè)部958號公告-12-2007前處理繁瑣,回收率稍低,靈敏度基本能夠滿足限量要求;農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008方法簡便快捷,靈敏度高,可以用于磺胺類藥物的陽性確證。
表4 水產(chǎn)品中磺胺類殘留標準測定方法
二、水產(chǎn)品獸藥殘留檢測能力驗證
能力驗證(proficiencytesting)也稱能力驗證計劃,是通過實驗室間測試結果的比對來判定實驗室能力的合格評定活動。近年來,農(nóng)業(yè)部組織開展了水產(chǎn)品中藥物殘留、重金屬及貝類毒素等3大方面檢測能力驗證,涉及的能力驗證考核參數(shù)包括氯霉素、孔雀石綠、鎘、鉛、麻痹性貝類毒素等20多項,有力地促進了質檢機構的運行和管理,提升了檢測人員的技術水平。
目前,獸藥殘留測定是進行水產(chǎn)品質量安全監(jiān)控的主要手段,氯霉素、孔雀石綠和硝基呋喃等禁用藥物是藥物殘留監(jiān)控的重點,為了確保水產(chǎn)品的質量安全,氟甲砜霉素、甲砜霉素、磺胺類和喹諾酮類等限用藥物也早已納入監(jiān)控工作。但是由于各個實驗室間的檢驗能力良莠不齊,有時會對檢驗數(shù)據(jù)的可靠性存在質疑,影響了監(jiān)控工作的權威性,因此監(jiān)管部門將能力驗證作為檢驗實驗室能力水平的一個主要的方式。
能力驗證(proficiency testing)是通過實驗室間比對,按照預先制定的準則來判定實驗室能力的活動。能力驗證是實驗室認可機構加入和維持國際相互承認協(xié)議(mutual recognition agreement, MRA)的必要條件之一,也是實驗室進行自我評價的手段[2]。中國農(nóng)產(chǎn)品能力驗證考核始于2003年,雖然起步較晚,但是實驗室能力驗證的方法標準均參考國外權威機構的標準制定,10多年來技術能力取得了長足的進步。能力驗證在檢測實驗室的覆蓋率逐年增加,監(jiān)管部門通過組織能力驗證,可以了解實驗室是否有能力勝任所從事的監(jiān)控工作;實驗室通過參加能力驗證,了解自身能力,將其作為內部質量控制的補充措施,滿足持續(xù)改進的要求。
根據(jù)能力驗證活動的要求,選擇正確的檢測方法標準,掌握檢測方法的操作要領和關鍵點,減少方法對檢測結果的影響是確保順利通過能力驗證工作的關鍵。在此基礎上,還建議采取做好準備工作,提高檢測能力,保證質量控制措施到位,以及對檢測數(shù)據(jù)進行正確的修約等如下保障措施,減少不滿意結果的產(chǎn)生。
對做好水產(chǎn)品獸藥殘留檢測技術能力驗證工作,特提出以下建議:
1、提前練習
按規(guī)定的標準操作程序或作業(yè)指導書進行操作,熟練掌握方法的前處理過程,并能重現(xiàn)方法的靈敏度和準確度。
2、 標準溶液核查
根據(jù)標準要求重新配置標準貯備液或購置有證標準溶液,并與在用標準溶液進行核對,保證標準溶液的有效性。
3、 考核樣品的處理
檢查編號是否準確,包裝是否完整、無破損,按照通知要求進行保存。嚴禁用微波等加熱方式對樣品解凍,應在室溫下自然解凍后再進行前處理。樣品前處理過程中,應盡量避光操作。
4、做好質量控制
質量控制中應包括空白實驗(包括試劑空白和對應的基質空白)和控制樣品(檢出限加標、3~10倍檢出限加標),與考核樣品同時測定??瞻讓嶒灴纱_??瞻字翟诳刂葡迌?,避免測試過程中的污染和空白基質中的干擾??刂茦悠返挠行钥纱_保測試結果的靈敏度和準確度。
5、 檢測結果的判斷
在進行檢測結果計算時,首先應考察校準曲線是否滿足要求,其次是平行樣的測定結果是否在相對偏差范圍內,然后是質控樣品的準確度和靈敏度是否符合標準要求,還要進行不確定度的計算。對于偏差較大的數(shù)據(jù),可以采用統(tǒng)計學方法進行測算,如平均值的置信區(qū)間等。
(內容參考食典報)
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