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色譜儀峰形前拖怎么辦

點(diǎn)擊: 次 時(shí)間:2017-06-05 15:03

一、概述

高效液相色譜方法的開(kāi)發(fā)過(guò)程中,一個(gè)總的原則是:先找到目標(biāo)化合物的峰,然后調(diào)整峰形,再是進(jìn)一步完善。本文主要介紹調(diào)整峰形中峰形前拖的解決方案。

二、峰形前拖問(wèn)題簡(jiǎn)介

峰形對(duì)稱性的優(yōu)劣對(duì)峰面積和分離度有很大的影響,從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,是色譜工作者不得不重視的問(wèn)題,也是讓大家最為頭疼的問(wèn)題之一。然而引起峰形異常的因素很多,如色譜柱本身裝填不好、強(qiáng)保留化合物對(duì)色譜柱的污染、填料中殘留硅羥基引起的次級(jí)保留效應(yīng)、柱頭塌陷、柱外死體積等等,針對(duì)不同的情況我們可以有不同的對(duì)策。在這里我們撇開(kāi)所有的污染、塌陷、死體積等其它因素,假設(shè)系統(tǒng)是好的,柱子是新的、好的,單純探討液相方法與峰形前拖之間的關(guān)系,通過(guò)調(diào)整液相方法來(lái)解決峰形前拖的問(wèn)題。

前拖峰在譜圖上有幾種表現(xiàn)形式,主要有以下3種,第一種比較明顯一些,后兩種,容易讓人懷疑這個(gè)峰里面是不是有兩種物質(zhì)沒(méi)有徹底的分開(kāi),第三種前拖更是讓人質(zhì)疑是否是色譜柱受到了污染引起的肩峰。

三、峰形前拖問(wèn)題消除方法

發(fā)現(xiàn)峰形前拖時(shí),建議按下面的步驟逐步排除可能的原因,然后找到相應(yīng)的對(duì)策,消除峰形前拖的狀況、改善峰形。

1、先檢查一下是否是樣品過(guò)載

樣品過(guò)載,通常會(huì)引起峰形變差,導(dǎo)致前拖、后拖或平頭峰,如果出現(xiàn)平頭峰、峰高超過(guò)2000mAU或峰很高的同時(shí)又前拖、后拖得很厲害通常都認(rèn)為是過(guò)載的,但這一點(diǎn)也并不絕對(duì),因?yàn)椴煌衔锏奈諒?qiáng)度不一樣,如果一種化合物在某一波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收,即使出現(xiàn)了平頭峰,樣品也不一定過(guò)載;相反如果吸收弱,則高濃度條件下峰也不見(jiàn)得有多高;所以樣品是否過(guò)載應(yīng)該結(jié)合濃度、進(jìn)樣體積和峰形一起來(lái)判斷。通常認(rèn)為峰高在100mAU左右比較合適,不至于因過(guò)載影響峰形。由于樣品過(guò)載引起的峰形前拖不容易消除,也可能根本無(wú)法消除,繼續(xù)采用以下的峰形改善措施可能不會(huì)有什么作用,而且在過(guò)載的情況下無(wú)法看清正常濃度時(shí)樣品真實(shí)的分離狀況和峰形,因此需要優(yōu)先考慮是否過(guò)載,否則繼續(xù)往下調(diào)整峰形的努力將無(wú)任何意義。

2、檢查是否是用流動(dòng)相溶解樣

不用流動(dòng)相溶解樣品容易在譜圖上產(chǎn)生溶劑峰和前拖(上述的幾種形狀的前拖都有),這種情況通常是在溶解樣品的溶劑(如純甲醇)洗脫能力比流動(dòng)相(如甲醇:0.4%磷酸溶液=38:62)強(qiáng)的情況下發(fā)生,如例2,而溶劑洗脫能力比流動(dòng)相相對(duì)較弱時(shí),目前未見(jiàn)此現(xiàn)象;也有人說(shuō)也會(huì)產(chǎn)生后拖,但本人做樣以來(lái)并沒(méi)有碰到過(guò)這種的情況。

正常的峰形應(yīng)該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的,濃度分布在整個(gè)通過(guò)色譜柱柱床的過(guò)程中任何時(shí)候都呈正態(tài)分布。 

為什么用洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)的溶劑溶解樣品會(huì)容易產(chǎn)生前拖? 

一種可能的解釋是,進(jìn)針后,在流動(dòng)相的推動(dòng)下樣品溶液很快到達(dá)色譜柱,此時(shí)樣品溶液未能被流動(dòng)相很快稀釋,結(jié)果是,作為樣品溶劑的局部濃度過(guò)大,由于甲醇的洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng),因此甲醇帶著部分樣品提前進(jìn)入到了填料里面,而另一部分則還沒(méi)來(lái)得及進(jìn)入填料周圍的環(huán)境就發(fā)生了變化——由甲醇變成了流動(dòng)相,所以一部分樣品提前被甲醇帶出來(lái)而另一部分沒(méi)有,導(dǎo)致樣品譜帶的濃度分布發(fā)生了變化,濃度中心偏離了正常峰時(shí)的位置。同時(shí)作為樣品溶劑的甲醇畢竟有限,只有幾十微升,因此只能帶著很少一部分樣品提前進(jìn)入填料,形成前拖。

根據(jù)這一解釋,出現(xiàn)這種前拖時(shí),似乎樣品只有在周圍環(huán)境與流動(dòng)相相同時(shí)才不會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象,如果用甲醇溶解的樣品濃度為10ug/ml時(shí)出現(xiàn)前拖(此時(shí)樣品周圍環(huán)境與流動(dòng)相不同),那么將1000ug/ml高濃度甲醇溶解的樣品用流動(dòng)相稀釋至原來(lái)濃度的1/100倍(此時(shí)樣品的濃度也為10ug/ml,周圍環(huán)境與流動(dòng)相也不完全相同),是不是也會(huì)出現(xiàn)前拖呢?很顯然不會(huì),因?yàn)樗陀昧鲃?dòng)相溶解已經(jīng)沒(méi)有什么區(qū)別,差異太小了,只有1/100。也就是說(shuō)不一定非得用流動(dòng)相溶解樣品才會(huì)消除這種因樣品溶劑而引起的前拖,那么到底要與流動(dòng)相差異多小才不會(huì)引起這種狀況呢?在我們的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),只要用流動(dòng)相將原樣品稀釋至原來(lái)濃度的1/4倍(體積比,原樣品溶液:流動(dòng)相=1:3混合)就可以達(dá)到和用流動(dòng)相溶解相似的效果。 

由此可以看出,不用流動(dòng)相溶解樣品對(duì)色譜峰形是有很大影響的,容易造成前拖,所以特別是開(kāi)發(fā)方法的時(shí)候盡量使用流動(dòng)相來(lái)溶解樣品。當(dāng)然,如果已經(jīng)用了較強(qiáng)的溶劑溶解樣品,得到了一個(gè)前拖峰,而重新用流動(dòng)相配制樣品又很麻煩時(shí),那么可以用流動(dòng)相將樣品稀釋至原來(lái)濃度的1/4倍,來(lái)粗略的考查一下,看是否是因未用流動(dòng)相溶解引起的。事實(shí)上,一直以來(lái)我們?cè)诳疾榉逍吻把右鸬脑虻臅r(shí)候經(jīng)常用這種更便捷的方式,省了不少時(shí)間,非常管用。

有時(shí)候同樣是用強(qiáng)溶劑溶解的在有些色譜柱中產(chǎn)生前拖,而另一些色譜柱中沒(méi)有,我個(gè)人認(rèn)為,這些填料可能是沒(méi)有封尾的,從填料鍵合的角度,裸硅膠上鍵合上C18長(zhǎng)鏈后仍然殘留了大量的硅羥基,殘留的硅羥基對(duì)水分子具有很強(qiáng)的吸附能力,硅膠表面的吸附水對(duì)所進(jìn)的樣品溶液產(chǎn)生了一種稀釋作用,使附帶樣品的甲醇失去了相對(duì)較強(qiáng)的洗脫能力,不再能很快帶著部分樣品進(jìn)入填料,而是均勻的進(jìn)到色譜填料中,樣品在色譜柱中的濃度分布未能產(chǎn)生偏移,因而出來(lái)的是正常峰。

    如果峰形仍然前拖則繼續(xù)往下調(diào)整。

3、增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度

增加緩沖鹽濃度可以增大流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度,減少因靜電的作用(有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間)引起的前拖。 

4、流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃

往流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃有時(shí)可以改善峰形、增大分離度,很多色譜工作者都知道和使用,但其機(jī)理似乎少人提及。通常所加入的量在5%以內(nèi)即可,需要的時(shí)候可以加入更大的量。

5、升高柱溫的溫度

 

升溫有助于增加流動(dòng)相傳質(zhì)速率,減少因靜電作用引起的前拖,但溫度不宜太高,溫度太高容易損傷色譜柱,特別是含有離子對(duì)試劑的時(shí)候,最好不要超過(guò)40度。

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