一、熊果酸介紹

熊果酸為山楂中的主要活性成分，具有抗高血脂、降血糖、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌等多種藥理作用，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能。2015年版藥典山楂項(xiàng)下未對(duì)其熊果酸建立含量測(cè)定。

二、方案簡(jiǎn)介

目的：建立山楂中熊果酸含量測(cè)定HPLC方法。

方法：采用高效液相色譜法檢測(cè)熊果酸含量，以甲醇-水（20：80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，流速為10ul。

結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍得熊果酸線性回歸方程為y=22.3880x+1.2043，相關(guān)系數(shù)r為0.9998，表明熊果酸在1～60μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。精密度RSD為1.09%，重復(fù)性RSD為1.83%，表明該方法重現(xiàn)性良好。72小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)熊果酸峰面積RSD為1.10%，表明該樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

結(jié)論：熊果酸可作為山楂質(zhì)量控制指標(biāo)之一，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可作為山楂中熊果酸的含量測(cè)定方法，可有效控制山楂的內(nèi)在質(zhì)量。

三、方案詳解

1、儀器及試藥 

1.1儀器

高效液相色譜儀（四元梯度系統(tǒng)），紫外檢測(cè)器，色譜柱為ZorbaxSB-C18（4.6×250mm，5μm），紫外可見分光光度計(jì)，數(shù)控超聲波清洗器，電子調(diào)溫電熱套，恒溫搖床。

1.2試藥

熊果酸對(duì)照品：(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110742-201212，供含量測(cè)定用)；山楂藥材（經(jīng)檢驗(yàn)為藥典品種的市售樣品）

2、方法與結(jié)果 

2.1山楂中熊果酸測(cè)定

本文采用高效液相色譜法測(cè)定山楂中熊果酸的含量，為山楂藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定

取熊果酸對(duì)照品，加甲醇溶解并制備成一定濃度的溶液，以甲醇為空白溶劑，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)資料報(bào)道，最后確定檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

2.1.2流動(dòng)相優(yōu)化

在文獻(xiàn)資料中，有用乙腈-水-磷酸、甲醇-磷酸鹽緩沖液、乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨等系統(tǒng)作為流動(dòng)相，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察后發(fā)現(xiàn)，這些系統(tǒng)存在或可能分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或樣品分離效果欠佳等因素。經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索后發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水系統(tǒng)可以很好的避免影響因素。

2.1.3色譜條件

以甲醇-水（80：20）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量為10μl。經(jīng)測(cè)定，分離度均大于2.0%，理論塔板數(shù)均在6000以上。

2.1.4熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取熊果酸對(duì)照品0.01272g，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液（濃度約1.0mg/ml）。

2.1.5供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)2號(hào)篩）0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，浸泡1h，超聲30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍

精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液，置量瓶中，分別制備1、2、5、10、20、60μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2.1.3項(xiàng)下的色譜條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得熊果酸線性回歸方程為y=22.3880x+1.2043，相關(guān)系數(shù)r為0.9998，表明熊果酸在1～60μg/ml的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.7供試品溶液制備方法的優(yōu)化

2.1.7.1取本品粉末（過(guò)2號(hào)篩，下同）0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，浸泡1h，水浴鍋加熱回流30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.7.2

取本品粉末0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，浸泡24h，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.7.3

取本品粉末0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，浸泡1h，超聲30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

經(jīng)測(cè)定，方法3的提取效率明顯優(yōu)于方法1、2，在結(jié)合實(shí)際工作中的可操作性和提取率，最后確定方法3作為最終的提取方法。

2.2精密度試驗(yàn)

取10μg/ml熊果酸對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得RSD為1.09%，表明儀器性能良好。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批山楂樣品5份，按上述樣品制備項(xiàng)下方法，依法操作制備樣品溶液。平行測(cè)定5次，結(jié)果熊果酸的平均含量為0.57%，RSD為1.83%。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批山楂制備的樣品溶液，在常溫下放置，分別于0、6、24、48、72h分別測(cè)定1次，結(jié)果RSD為1.10%，表明該樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.5回收率試驗(yàn)

精密稱取已知熊果酸的山楂樣品約0.5g，共5份，分別精密加入對(duì)照品溶液(熊果酸濃度為0.05088mg·ml-1)10ml，按上述樣品制備方法制備加樣回收供試品溶液并注入高效液相色譜儀，計(jì)算平均回收率。

3、討論

山楂作為常用的中藥材（飲片）之一，在2015年版藥典收錄的方法中，未采用HPLC或者更先進(jìn)的方法測(cè)定其活性成分的含量。本實(shí)驗(yàn)方法剛好彌補(bǔ)了這個(gè)空缺，更好的體現(xiàn)中藥現(xiàn)代化要與時(shí)俱進(jìn)的要求，更符合中國(guó)中藥標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化的要求。

本方法操作簡(jiǎn)便，較更好的鑒別山楂內(nèi)在質(zhì)量的優(yōu)劣，可以替代熊果酸薄層鑒別，更具有科學(xué)性。

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